Rauntíma flúrljómunar magn PCR er aðferð til að mæla heildarmagn vöru eftir hverja pólýmerasa keðjuverkun (PCR) hring í DNA mögnunarhvarfi með því að nota flúorófór.Aðferðin er notuð til að magngreina sérstakar DNA-raðir í sýninu sem á að prófa með innri eða ytri viðmiðunaraðferðum.Frá upphafi hafa flúrljómandi megindlegar PCR mælingar orðið sífellt vinsælli meðal rannsóknarstofukennara.
Flúrljómun PCR meginreglan: Flúrljómun PCR, fyrst kallaður TaqManPCR og síðar einnig Real-TimePCR, er ný kjarnsýru magngreiningartækni þróuð af PE (PerkinElmer) í Bandaríkjunum árið 1995. Tæknin byggir á því að bæta við flúrljómandi merktum rannsaka eða samsvarandi flúrljómandi litarefni til hefðbundins PCR til að ná megindlegri virkni sinni.Meginreglan: eftir því sem PCR hvarfið heldur áfram safnast PCR hvarfefnin upp og styrkur flúrljómunarmerkisins eykst í jöfnu hlutfalli.Með hverri lotu er flúrljómunarstyrksmerki safnað þannig að við getum fylgst með breytingu á vörumagni með breytingu á flúrljómunarstyrk og fengið þannig flúrljómunarmögnunarferil.
Almennt má skipta flúrljómunarmögnunarferlinum í þrjá fasa: flúrljómunarbakgrunnsmerkjafasa, flúrljómunarmerkja veldisvísismögnunarfasa og hálendisfasa.Meðan á bakgrunnsmerkjafasa stendur er magnaða flúrljómunarmerkið dulið af flúrljómunarbakgrunnsmerkinu og ekki er hægt að ákvarða breytingar á magni vörunnar.Í hálendisfasanum eykst mögnunarafurðin ekki lengur veldisvísis, ekkert línulegt samband er á milli magns lokaafurðar og upphafssniðmátsmagns og ekki er hægt að reikna upphafs-DNA afritafjölda út frá loka PCR vörumagni.Aðeins í veldismögnunarfasa flúrljómunarmerkisins er línulegt samband á milli logaritma PCR vörumagnsins og upphafssniðmátsmagnsins og við getum valið að mæla það á þessu stigi.Til þæginda fyrir magngreiningu og samanburð, hafa tvö mjög mikilvæg hugtök verið kynnt í rauntíma flúrljómandi magn PCR tækni: flúrljómunarþröskuldur og CT gildi.
Þröskuldurinn er tilbúið stillt gildi á flúrljómunarmögnunarferlinum.veldisfasa PCR mögnunar.
Ct gildi: er fjöldi lota sem flúrljómunarmerkið í hverju hvarfröri hefur gengið í gegnum til að ná settu lénsgildi.
Sambandið á milli Ct gildisins og upphafssniðmátsins: rannsóknir hafa sýnt að Ct gildi hvers sniðmáts hefur línulegt samband við logaritma upphafsnúmers þess sniðmáts, því fleiri afrit af upphafseintaksnúmerinu, því minni er Ct gildi.Ct gildin eru tiltölulega stöðug.Hægt er að búa til staðlaða feril með því að nota staðal með þekkt upphafsafritsnúmer, þar sem lárétt hnit táknar lógaritma upphafsafritsnúmersins og lóðrétt hnit táknar Ct gildi eins og sýnt er á myndinni hér að neðan.
Þess vegna, með því að fá Ct gildi óþekkts sýnis, er hægt að reikna upphafsafritsnúmer þess sýnis út frá stöðluðu ferlinum.
Ct gildið er ekki stöðugt og mismunandi sýni og mismunandi tæki geta haft áhrif á það, jafnvel þótt sama sýni sé endurtekið 2 sinnum á sama tækinu getur Ct gildið verið breytilegt.
Megindlegar flúrljómunarprófanir: Magnflúrljómunarprófum má skipta í flúrljómunarnema og flúrljómandi litarefni eftir því hvaða merki eru notuð.Fluorescent sondes eru Beacon tækni (sameinda beacon tækni, táknuð með American Tagyi), TaqMan rannsaka (fulltrúi ABI) og FRET tækni (fulltrúi Roche);flúrljómandi litarefni innihalda mettuð flúrljómandi litarefni og ómettuð flúrljómandi litarefni, dæmigerður fulltrúi ómettaðra flúrljómandi litarefna er SYBRGreen I, sem er almennt notað núna;mettuð Dæmigerður fulltrúi ómettaðra flúrljómandi litarefna er SYBRGreenⅠ;mettuð flúrljómandi litarefni eru EvaGreen, LCGreen o.s.frv.
SYBRGreenI er algengt DNA bindandi litarefni fyrir flúrljómandi PCR, sem binst ósértækt tvíþátta DNA.Í frjálsu ástandi gefur SYBRGreenI frá sér veikt flúrljómun, en þegar það er bundið við tvíþátta DNA eykst flúrljómun þess 1000-falt.Þess vegna er heildarflúrljómunarmerkið sem gefið er frá sér við hvarf í réttu hlutfalli við magn tvíþátta DNA sem er til staðar og eykst eftir því sem mögnunarafurðin eykst.
Kostir tvíþátta DNA bindandi litarefna: Einföld tilraunahönnun, aðeins þarf að nota 2 grunna, engin þörf á að hanna rannsaka, engin þörf á að hanna marga rannsaka fyrir hraðprófanir á mörgum genum, hæfni til að framkvæma bræðslumarksferilgreiningu, prófa sérhæfni mögnunarviðbrögð, lágur upphafskostnaður, góð almenning og því algengari í rannsóknum heima og erlendis.
Fluorescent probe aðferð (Taqman tækni): Þegar PCR mögnun er framkvæmd er pari af primer bætt við ásamt sérstökum flúrljómandi rannsaka.Þegar rannsakandinn er ósnortinn, frásogast flúrljómunarmerkið sem sendir hópurinn gefur frá sér af slökkva hópnum og er ekki greint af PCR tækinu;meðan á PCR mögnun stendur (í framlengingarfasa), 5'-3' klofningsvirkni Taq ensímsins brýtur niður rannsakann á ensímfræðilegan hátt, sem gerir reporter flúrljómunarhópinn og slökktan flúrljómunarhóp
Notkun flúrljómandi magns PCR.
Sameindalíffræðirannsóknir:
1. Magnbundin kjarnsýrugreining.Megindleg og eigindleg greining á smitsjúkdómum, greining á sjúkdómsvaldandi örverum eða vírusum, svo sem nýlega inflúensu A (H1N1) faraldur, greining á fjölda genaafrita erfðabreyttra plantna og dýra, greining á hraða RNAi gena óvirkjunar o.s.frv.
2. Mismunandi genatjáningargreining.Samanburður á mismun á genatjáningu á meðhöndluðum sýnum (td lyfjameðferð, líkamleg meðferð, efnameðferð o.s.frv.), tjáningarmun tiltekinna gena í mismunandi áföngum og staðfesting á niðurstöðum cDNA örfylkis eða mismunatjáningar.
3. SNP uppgötvun.Greining á fjölbrigðum einskirna er mikilvæg fyrir rannsókn á næmi einstaklings fyrir mismunandi sjúkdómum eða svörun einstaklings við tilteknum lyfjum og vegna snjallrar uppbyggingar sameindavita, þegar raðupplýsingar SNP eru þekktar, er auðvelt og nákvæmt að notaðu þessa tækni til að greina SNP með miklum afköstum.
4. Metýlerunargreining.Metýlering tengist mörgum sjúkdómum í mönnum, sérstaklega krabbameini, og Laird greindi frá tækni sem kallast Methylight, sem meðhöndlar DNA fyrir mögnun þannig að ómetýlerað cýtósín verður úrasíl og metýlerað cýtósín er óbreytt með því að nota sérstaka primera og Taqman rannsaka til að greina á milli metýleraðs og ómetýleraðs DNA .viðkvæmari.
Læknisrannsóknir:
1. Fæðingargreining: fólk getur ekki meðhöndlað arfgenga sjúkdóma af völdum breytts erfðaefnis og enn sem komið er getur það aðeins fækkað veikum börnum sem fæðast með fæðingareftirliti til að koma í veg fyrir að ýmsir arfgengir sjúkdómar komi upp.Þetta er ekki ífarandi aðferð sem er auðveldlega samþykkt af þunguðum konum.
2. Uppgötvun sýkla: Flúrljómandi megindlega PCR-greiningin gerir magnbundinni ákvörðun sýkla eins og gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, papillomaveiru manna, herpes simplex veira, ónæmisbrestsveiru manna, lifrarbólguveiru, inflúensuveiru, Mycobacterium tuber-veiru, mycobacterium tuber-veiru.Það hefur kosti mikillar næmni, lítillar sýnastærðar, hraða og einfaldleika miðað við hefðbundnar prófunaraðferðir.
3. Mat á verkun lyfja: megindleg greining á lifrarbólgu B veiru (HBV) og lifrarbólgu C veiru (HCV) sýnir að sambandið milli veiruálags og virkni ákveðinna lyfja.Ef styrkur HBV-DNA í sermi lækkar meðan á lamivúdínmeðferð stendur og eykst síðan aftur eða fer yfir fyrra magn, er það vísbending um stökkbreytingu í veiru.
4. Krabbameinserfðafræðilegar prófanir: Þótt verkunarháttur æxlisþróunar sé ekki enn ljós, er almennt viðurkennt að stökkbreytingar í viðkomandi genum séu undirliggjandi orsök krabbameinsvaldandi umbreytingar.Aukin tjáning og stökkbreytingar á krabbameinsgenum má sjá á fyrstu stigum margra æxla.Rauntíma flúrljómunar magn PCR er ekki aðeins áhrifaríkt við að greina stökkbreytingar í genum, heldur getur það einnig greint tjáningu krabbameinsgena nákvæmlega.Þessi aðferð hefur verið notuð til að greina tjáningu ýmissa gena, þar á meðal telomerasa hTERT genið, langvarandi kyrningahvítblæði WT1 genið, krabbameinsvaldandi ER genið, PSM genið fyrir krabbamein í blöðruhálskirtli og veiru gen sem tengjast æxlum.
Þýtt með www.DeepL.com/Translator (ókeypis útgáfa)
Birtingartími: 21. júní 2022